单粒子冷冻电镜（single-particle cryo-EM），已经成为解析其他方法难以获得的大型动态蛋白质结构的有力工具。该技术中蛋白质是在原生环境的自然状态下进行成像，这样不仅可以大大减少样品的消耗，而且可以捕捉到不同功能状态下蛋白质的各种构象。2013年以来冷冻电镜技术硬件设备和图像算法的不断突破，解析出了许多之前令人棘手的蛋白结构，包括核糖体一类的大蛋白复合体，集成膜蛋白，高异质性和构象性动态系统[5]等，引起了结构生物学的一场分辨率革命。直到2020年，两项利用最新技术的工作，生成了迄今为止最清晰的蛋白结构（1.2Å分辨率的apoferritin蛋白），里程碑式的首次通过冷冻电镜分辨出了蛋白质的单个原子。原子级别的结构解析能力对于理解关键蛋白（酶）如何工作具有重要意义，其中许多膜蛋白与疾病直接相关，对于其结构的分析可为药物开发提供靶点，促进能抑制其活性的药物发现。

目前，在实际的结构生物学研究中，冷冻电镜的技术瓶颈已转移到了样品制备，存在的主要问题包括电子束引起的样品运动、空气-水界面对蛋白质的吸附以及颗粒缺乏多样化取向等。特别是对于不稳定的蛋白质来说，样品制备成为该领域的主要挑战。无论冷冻电镜的硬件技术和软件算法是否会有进一步发展，这些障碍加在一起都会延缓项目的进展，并且阻碍蛋白结构的解析。因此，样品制备决定了单粒子冷冻电镜技术的效率和可用性。开发新的方法和技术，将是完全消除这些障碍的必要条件。在样品制备的要素中，样品基底的优化设计是获取更高分辨率的关键途径之一，在解决相关障碍方面起着决定作用。例如，在上述原子分辨率的工作中，蛋白颗粒保持稳定不动是不可或缺的关键因素，因而两项工作都不约而同的使用了一种超稳定的具有微米孔金膜的基底。

做为冷冻电镜超稳基底的纳米孔金膜技术，聚焦于当前冷冻电镜关键前沿问题之一的样品制备，通过纳米技术、光学和材料等学科的综合交叉应用，进行样品基底的优化和功能扩展，解决样品制备中存在的瓶颈问题，提高冷冻电镜技术的结构解析能力、可用性和效率。相关技术是2020年10月发表于《Science》的最新研究成果（“Cryo-EM with sub-1Å specimen movement” Science 370, 223 2020)。我们表明电子束导致的样品运动是由悬浮冰的弯曲和变形引起的，其阈值直接取决于样品基底设置的冰层的几何形状。基于该理论和大面积独立自支撑的纳米孔金膜技术，我们设计了一个纳米孔（直径<300nm）金膜基底，彻底消除了样品冰层的弯曲，由此将电子束引起的粒子移动减少到小于1Å。最重要的，超稳基底上的无运动成像，使在照射损伤开始之前‘零电子’照射状态下外推三维图成为可能。在保证数据质量的前提下，最大密度的纳米孔大大提高了自动化冷冻电镜的效率。通过这个可获得的、廉价的样品基底的开发和商业化，将使研究者能更快速地获得更好的图像。有望在未来以更高的效率产生各种蛋白质不同构象或组成状态的高分辨率结构集合。

超稳纳米孔金膜基底的性能和时效性已经在实际应用中进行了测试。例如，在新冠病毒RNA剪切酶（SARS-CoV-2 RNA polymerase）结构解析的最新工作中（PNAS 118, e2021946118 2021），对比使用了石墨烯+微米孔金膜基底和超稳纳米孔金膜基底。石墨烯+微米孔金膜上的数据集显示在照射开始时典型的电子束导致的运动，而这种运动在使用超稳纳米孔金膜基底时被消除。特别是在照射开始当蛋白受损最小时，超稳纳米孔金膜基底提供了更高的数据质量。在对最终高精度3D重构做出贡献的蛋白颗粒中，80%来源于超稳纳米孔金膜基底，只有20%来源于石墨烯基底。另一项使用超稳纳米孔金膜基底的新工作是确定了来自紫花苜蓿菌的光捕获-2（LH2）复合物的2.4 Å分辨率结构(Science Advance 7, eabe4650 2021)。结构细节揭示了紫色细菌LH2复合物的组装和低聚物形成的关键方面，这些是以前任何技术都无法实现的。对纳米孔金膜基底上获得的数据进行贝叶斯处理，无法拟合出明显的粒子运动，也没有发现明显的畸变或各向异性放大。这些都表明成像过程中粒子没有明显移动。在10至2.5 Å分辨率范围内，通过重建用来外推结构因子到零值，最终三维结构达到了2.38 Å的分辨率。

图 1 基于纳米孔金膜的超稳冷冻电镜样品基底